最新の研究成果

がん細胞から分泌されるナノ粒子は疾病マーカーとして注目を集めていますが、細胞上清中の夾雑物（きょうざつぶつ／測定対象以外の混合物）を除去して検出するには3～4時間もかかる超遠心分離が必要でした。物理系出身の藤原氏と、生物系出身の高木研究員を中心とした異分野融合チームで、光圧と光濃縮用の試薬の最適化に注力しました。超遠心を省略して5分程度で1～2桁の高感度化に成功し、超早期診断に向け大きく前進しました。

研究の背景

ヒト細胞を含む生体細胞は、さまざまな小胞構造から構成されており、エクソソームやエクトソームなどのナノスケールの細胞外小胞（EV）は、細胞間コミュニケーションのために細胞外に分泌されます。エクソソームを含む直径50～150 nmのナノスケールEVは、細胞間コミュニケーションの担い手の一つとしてだけでなく、細胞由来のmicroRNA、mRNA、タンパク質などを含むことから、さまざまな疾患のバイオマーカーやドラッグデリバリーのカプセルとしても注目されています。そのため、微量試料からナノスケールEVを迅速かつ高感度に検出することは、がんやアルツハイマー病などの難治性疾患の早期診断に特に有用であると考えられます。しかしながら、細胞上清からエクソソームなどのナノスケールEVを抽出するには、数時間の複雑な工程を要する超遠心分離を行う必要がありました。

本研究チームの従来の光濃縮検出研究では、光の力で捕捉した金属ナノ粒子集合体の発熱効果による対流でDNAの二重鎖形成の光誘導加速に成功しており（T. Iida, et al., Sci. Rep. 2016)、さらに抗原抗体反応のマイクロフロー光誘導加速によるタンパク質の微量検出にも成功しています（T. Iida, et al., Commun. Biol. 2022）。しかし、エクソソームなどのナノスケールEVは光の波長より小さく、光圧の作用も弱いだけでなく発熱効果による対流を用いた場合には熱的ダメージも懸念され、微量検出にこれらの方法論が使えるかどうかはこれまで不明でした。また、夾雑物を多く含む細胞上清に適用できるかどうかも未解決の重要課題でした。

研究の内容

本研究では、大腸がん細胞株および肺がん細胞株から分泌されたEVを標的として、それぞれのEV表面の複数種類の膜タンパク質の各々と特異的に結合する抗体を修飾した直径2 μmのビーズを幅100 μm程度のマイクロ流路中に一定流量で導入し、レーザー照射により生じる光圧による濃縮・集積化を行いました（図１）。さらに、マイクロフロー光濃縮により形成された抗体修飾ビーズとEVの集積構造の光学透過像を観察し、全集合面積に対する多層部分（黒色部分）の面積の割合を、レーザースポット位置を変えて測定し（図2（a））、スポット位置65 μm下方の時が最も高い直線性が得られることを確認しました（図2（b）はこの条件での透過像）。さらに、同じスポット位置で共焦点光学システムを用いて3次元解析を行ったところ、EV量と立体的な集積構造の側面から見た場合の面積もEV濃度と正の相関を示すことを明らかにしました。これらの結果は、レーザースポット位置を変化させることで光誘起力の強さを変調し、検量線の直線性と誤差を制御できる可能性も示しています（図2（a））。

図2: (a)大腸がん由来EV標準品のマイクロフロー光濃縮による定量評価の各レーザースポットでの結果
各EV濃度における(b)光学透過像 (c)共焦点光学像

本研究では、飯田所長、床波副所長、中瀬所長補佐が共同で研究を開始し、研究デザインに貢献しました。藤原佳奈氏（飯田研で2023年修士取得）、高木裕美子研究員（飯田研研究員）、飯田所長、床波副所長はEVの光濃縮の実験を実施しました。また、藤原氏と高木研究員はELISAによる比較実験を行いました。藤原氏、大村美香氏（中瀬研現M2）、森本健太氏（中瀬研で2023年修士取得）、中瀬所長補佐が培養細胞株からのEV抽出とナノポア計測を行いました。田村守特任講師と飯田所長は光濃縮の理論計算を実行しました。  

期待される効果・今後の展開

資金情報

本研究はJST未来社会創造事業「低侵襲ハイスループット光濃縮システムの開発 （JPMJMI18GA、JPMJMI21G1）」（研究開発代表者：飯田琢也）、JST創発的研究支援事業「バイオミメティック電極による外場誘導型エコシステムの創成(JPMJFR201O)」（研究代表者：床波志保）、科研費基盤研究（A）（17H00856、21H04964）（研究代表者：飯田琢也）、大阪府立大学キープロジェクト（「LAC-SYSプロジェクト ―次世代バイオフォトニクスが拓く未来―」）などの支援の下で実施されました。

用語解説

※1 超遠心分離機：遠心分離機の中でも超高速回転に最適化され、重力加速度（9.8 m/s²）の100万倍の加速度（10⁶ G）を生み出す装置。分子生物学、生化学、高分子科学で用いられることが多く、分離用と分析用がある。従来、エクソソームなどナノスケールのEVを単離・生成するには超遠心分離機が必要であった。

※2 エクソソーム、エクトソーム：直径100 nm程度のナノスケールな細胞外小胞（extracellular vesicle、EV）のことを指す。テトラスパニンと呼ばれる4つの膜貫通ドメインを持つ膜タンパク質によって特徴付けられ、これらのタンパク質に抗体を選択的に結合させる分析方法を使用して検出することが可能。エクソソームは細胞内で産生されて細胞外に分泌されるのに対し、エクトソームは細胞膜が出芽してできるEV（直径はエクソソームより大きく数百nm程度）である。エクソソーム、エクトソームはともに、細胞間コミュニケーションを担う生物学的ナノ粒子として、内外にタンパク質や核酸などを保持し、医療検査用のマーカーやドラッグ・デリバリーシステムの医薬品キャリアとしても注目されている。

※3 光の力：光誘起力のことで、光が物質に及ぼす電磁気学的な力の総称。直進するレーザー光を物質に照射すれば、「押す」力を与えることができ、レンズで強く絞ったレーザー光の強度の強いスポット付近に物質を捕捉することができる。

※4 共焦点光学システム：主に蛍光イメージングに基づく顕微鏡観察において、高解像度かつ３次元情報の再構築を可能とする光学系のこと。検出装置の手前に配置したピンホールにより、焦点の合っている位置から発せられる蛍光以外の光を遮断し、立体的な試料の観察において従来の顕微鏡よりも鮮明な蛍光スライス像を取得し、それらを重ね合わせて次元像を再構築できる。

※5 ELISA：酵素結合免疫吸着法（enzyme-linked immunosorbent assay）。抗体を修飾したプレート上に検出対象物質と酵素標識した抗体を含む液体試料を滴下後、静置と洗浄を繰り返し、選択的に抗体に結合した検出対象物質を光吸収により測定する。 計測に5～6 時間必要。

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