研究紹介（中島）

研究内容

タンパク質をベースとする新たなセンサー機構の試み

詳細はこちら 酵素反応をセンシングに利用するバイオセンサーは、酵素の基質認識能を利用するため、選択的な物質検出が可能です。また、生体への適合性も高いことから、様々な分野で活発な利用と研究がなされています（文献1）。一般にセンサーは、物質の有無や環境の変化を感知し、何らかの1次シグナルを生成するセンシング部位と、1次シグナルを計測可能な2次シグナルへと変換するシグナル変換部位から構成されています。2次シグナルには、検出が簡便でデータの加工が容易な電気的シグナルが汎用されていて、酵素を用いるバイオセンサーについてもこの点は変わりません。ただし、酵素にはもともとの機能としてシグナル変換の機能はありませんので、センシング部位で生成する1次シグナル（つまり酵素反応）自体が、電気的シグナルを発生するような場合が多いといえます。つまり、センシング部位に利用される酵素は、酸化還元反応を伴うものが大半を占め、これがバイオセンサーの応用範囲を限定される要因の一つとなっていると考えられます。ところで、天然のセンサータンパク質では、「センシングに伴う1次シグナル（結合の生成・解裂等の反応）の発生→ タンパク質構造の変化→ 2次シグナルの発生」が一般的な動作機構であり、タンパク質の高次構造変化が、シグナルの伝達・変換を担います。天然センサータンパク質を対象とした我々の研究でも明らかにしてきましたが、高次構造変化によるタンパク質におけるシグナル伝達過程とは、センサー部位で生じる局所的な構造変化を起点とする、タンパク質機能部位（ドメイン）間の配置変化であることが数多く報告されています（図1）。こうしたタンパク質高次構造変化を人工的に再現できれば、シグナル伝達機構を有するバイオセンサーを作り出すことが可能となり、バイオセンサー自体の応用範囲が拡大すると考えられます。しかし、天然と同等の仕組みを人工的に単一のタンパク質を用いて分子レベルで設計することは、未だ難問であり、関連する研究への取組みは、国内外を問わずほとんど知られていません（文献2）。 我々は、この問題に対し、センサータンパク質のシグナル変換過程である「分子構造変化」を、特定タンパク質間における「動的な分子間相互作用の変化」として実現することを考案しました。具体的には、一組の電子伝達タンパク質（今のところ、アズリン－チトクロムc）と環境応答性分子からなる動的な相互作用系を構築します（図2）。この系では、電子伝達タンパク質が、電子伝達の過程で生成する一時的な相互作用を一つの「高次構造」と捉えます（思い込みます）。そして、この相互作用をタンパク質（図ではアズリン）に導入した環境応答性分子のセンシング過程に連動させて、変化させます。相互作用の変化は、タンパク質間の電子伝達速度の変化に反映されるため、環境応答性分子によるセンシング過程は、最終的に電気的なシグナルに変換、計測することができるはずです。この系では、電子伝達タンパク質間の相互作用変化がシグナル変換を担うため、センシングに伴って構造変化する様々な環境応答性分子に応用可能だと考えています。これまでの研究ではすでに、熱応答性ポリマーであるポリイソプロピルアクリルアミド（PNIPAM）類縁体を環境応答部位に用いた系の構築に成功しており、PNIPAMの形状転移温度（32C）前後でタンパク質間の電子伝達速度に明確な変化が生じることを確認しています（図3）。現在は、この相互作用系の電極への集積を図り、分子単位で観測される温度依存的な電子伝達速度の変化を電極電流の変化として、計測できる仕組みへのビルドアップを進めています。また、環境応答部位として、PNIPAM等の環境応答性分子に加え、オリゴDNAやペプチドを利用し、この部位に特異的に結合する分子やタンパク質の存在を電子伝達速度の変化、そして、電流値の変化として計測するシステムの構築の実現をめざした研究も行っています。それらを通じて、我々の系が多様な環境応答部位の変化を電気的シグナルへ変換可能な仕組みであることを検証してゆきます。バイオセンサーの応用分野拡大をめざす研究は、現在も活発に行われていますが、主な成果は、センサーに適応可能な新たな酵素の発見や、酵素反応生成物を検出するための電極材料の工夫に集中しています。これらは、ほとんどが既存のバイオセンサーの構造（シグナル変換機能がタンパク質部分に存在しない）を前提としています（本業の方々からは、違う！と怒られるかもしれませんが）。我々のアプローチは、天然センサータンパク質の「構造変化を介したシグナル変換の仕組み」に着想を得、そのエッセンスを様々なバイオセンサーに応用可能な、簡便な相互作用系（アズリン／チトクロムc電子伝達系）で再現することを目的としており、従来からの研究とは異なる発想に基づくものであると考えています。ケミカルバイオロジーに欠かせないDNA、ペプチドチップの検出方法は、現在、蛍光など光学的手法が主流であるが、本系を応用すれば、検出結果を電気的な信号として直接計測することもできるようになるかもしれません。
引用文献） 1. L. Murphy et al., Biosensors and bioelectrochemistry, Curr. Opin. Chem. Biol. 2006, 10, 177. 2. 数少ない例として、Benson, D. E., Conrad, D. W., de Lorimier, R. M., Trammell, S. A., Hellinga, H.W., Science 2001, 293, 1641. 関連する我々の論文より） 1. Azurin-Poly(N-isopropylacrylamide) Conjugates by Site-Directed Mutagenesis and their Temperature Dependent Behavior in Electron Transfer Processes Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 1946-1949, Rosenberger N., Studer A., Takatani N., Nakajima H., Watanabe Y. アズリンに固定した温度応答性ポリマー（PNIPAM）はアズリン上でも温度依存的な構造変化を示す。この構造変化がアズリンとシトクロムcの相互作用に摂動を与えることで、タンパク質間の電子伝達速度が変化する。 2. Azurin-DNA Conjugate with Binding Motif of a Transcriptional Regulator, CooA: CO Dependent Modulation of Electron Transfer Reaction, Chem. Lett. 2014, 43, 1204-1206, Nakajima H., Miyazaki S., Itoh T., Hayamura M. Watanabe Y. 2009年ACIEの展開研究です。ここでは、PNIPAMの代わりにDNA+転写制御因子の組み合わせを用い、転写制御因子が外部刺激を感知した際に生じるDNAに対する結合能の変化を電子伝達タンパク質間の電子移動速度の変化へと変換することに成功しています。現在は、この仕組みを応用し、転写制御因子を素子に用いるバイオセンサーの開発を進めています。

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中島1-1 中島1-2

好熱菌由来タンパク質から耐熱性ペルオキシダーゼを創る

詳細はこちら 一般にタンパク質は壊れやすく、中性の水溶液かつ室温付近以外の条件では、すぐに機能を消失すると考えがちです。しかしこれは、普段　目にするタンパク質が我々の細胞と同じ成育環境で機能する細胞に由来するからであり、（我々から見て）過酷な環境下で生育する微生物（極限環境微生物）が産生するタンパク質は、その環境で機能するための優れた特性を有しています。例えば、私たちが研究の対象としている好熱菌（Thermus thermophilus HB8）は、もともと伊豆地方にある温泉の噴気孔で発見されたもので、菌体を構成するタンパク質は、100 C に近い温度でも変性することなく機能することが知られています。好熱菌由来タンパク質は、耐久性や耐有機溶媒性に優れたものも多く、我々の「タンパク質はもろくて使えない」という観念を覆し、現在では、様々な分野で利用が進んでいます（文献1, 2）。　好熱菌には様々な機能を有するタンパク質が存在するでしょうから、その一つ、一つを単離し、特性を調べてゆけば、有用なタンパク質を見つけることは、これからも可能でしょう。ただしこれでは、化学者の出番はありません。化学者である私としては、好熱菌由来タンパク質の優れた性状を維持・利用しつつ、化学のチカラを使って新奇な機能性タンパク質を作りたいものです。 好熱菌由来タンパク質を人工酵素・機能性タンパク質の基盤として用いる利点して、 1) 大腸菌を宿主とする組換え体として、タンパク質を大量に得られる場合が多い。 2）タンパク質が高温でも安定であるため、精製および精製後の取り扱いが容易である。 3）複数の変異導入に対しても、もとの高次構造を保つことが多く、機能設計がしやすい。 が挙げられます。1）, 2） は研究の本質には、関係なさそうなことですが、生成・精製が簡単というのは、日々の研究では、結構重要です。以下では、好熱菌由来タンパク質を使った我々の研究を簡単に紹介します。 我々は、Thermus thermophilus由来タンパク質の中から、立体構造が明らかであり、ヘム（鉄プロトポルフィリン誘導体）を補因子として有する電子伝達タンパク質、シトクロムc552（Cyt c552, 図1）を選び、これを基盤分子とする耐熱性ペルオキシダーゼの創製を試みました。ペルオキシダーゼ反応には、触媒作用の鍵となる一般酸－塩基触媒機構というものがあります（図2）。電子伝達タンパク質であるCyt c552 には、もともとこうした機構はありませんので、ヘムの近傍で変異導入を行い、人工的に触媒機構を組み込みます。タンパク質の立体構造をよく眺め、ヘム鉄の上方およそ5.2 に位置するVal49をアスパラギン酸に置換しました。Cyt c552のヘムは、八面体６配位構造をとっており、鉄イオン上には、反応を起こすための配位部位がありません。そこで、もとの配位子の一つであるMet69をアラニンに置換し、鉄イオンの配位座を一つ空位にしました。こうして得られた変異体（V49D/M69A）のヘム近傍を模式的に示すと図2のようになります。この変異体のペルオキシダーゼ活性を図3に示します。V49D/M69A変異体の触媒活性（図3a, ○）は、温度の上昇に伴って増大しており、熱による反応速度の上昇が触媒活性に反映されています。以前報告されているミオグロビンのH64D変異体（基質の種類によっては、天然に匹敵する高いペルオキシダーゼ活性を示す）と比較すると（図3a, △）、40Cまでの触媒回転数ではMb H64Dが上回るものの、60および70Cでは、V49D/M69A変異体がミオグロビン変異体を大幅に上回る触媒回転数を示します。なお80Cにおける急激な活性低下は、未同定配位子によって6配位型ヘムが生成し、活性部位が塞がれるためであり、タンパク質は無傷であることを確認しています。このため、温度を少し下げると再び触媒活性が出てきます。80Cになると触媒のブレーカーが落ちるような感じでしょうか。高温条件下におけるV49D/M69A変異体の優位性は、活性の持続性にもみられます。図3bは、V49D/M69A変異体およびMb H64D変異体を用いて、70Cでペルオキシダーゼ反応を行った際にみられる基質消費量の経時変化を示しています。V49D/M69A変異体は、ミオグロビン変異体より常に基質消費量で上回っており、触媒活性の持続性においてもミオグロビン変異体よりも優位であることが分かります。以上の結果は、V49D/M69A変異体が、高温条件下で、高い触媒活性とその持続性をもつことを示しており、タンパク質本来の耐熱・耐久性が高温域における触媒活性の発現にも有効に機能することを物語っています。 　図3bからも明らかなように、V49D/M69A変異体の酵素活性は、200秒付近を境に急速に低下しています。様々な検討の結果、この現象は、タンパク質が熱で変性したためではなく（タンパク質の骨格自体は、失活後もそのまま残っていることがわかっています。）触媒反応の過程で活性中心であるヘムが分解するためであることを突き止めました。人工酵素として更なる耐熱・耐久性を追究するにはこの問題を解決する必要がありましたが、現在では、この失活過程がどのような反応経路で進むのかを解明し、活性低下を抑制するための分子デザインを行うことも可能となりました。その結果、最新の変異体を用いたペルオキシダーゼ反応では、70Cでも1時間以上触媒活性を持続させることに成功しています。 我々は、ここで紹介したものの他にも好熱菌由来Cyt c552使った研究を進めています。その過程で、このタンパク質が、一般的な常温細胞由来のチトクロムcとは異なる性質を示すことがわかってきました。 引用文献） 1. 「極限環境微生物とその利用」堀越弘毅、関口武司、中村　聡、井上　明　著、講談社サイエンティフィック、2000年、東京 2. Thermophiles Biodiversity, Ecology, and Evolution, A. –L. Reysenbach, M. Voytek, and R. Mancinelli Ed., Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2001, NY. 関連する我々の論文より） 1. Cytochrome c552 from Thermus Thermophilus Engineered for Facile Conversion of the Prosthetic Group, Biochemistry Accepted, Ibrahim, Sk. Md., Nakajima, H., Ramanathan, K., Takatani, N., Ohta, T., Naruta, Y., Watanabe, Y. シトクロムcには、補欠分子族であるヘムとタンパク質骨格との間に共有結合があるため、ヘムをタンパク質から除去し、非天然の分子に置換するには、時間と手間がかかり、反応収量も高くありません。我々は、好熱菌由来のタンパク質Cyt c552を利用することで、「ヘムの除去、非天然分子への置換、置換分子とタンパク質骨格との共有結合形成」を簡単に行う仕組みを創り出しました。 2. Molecular Design of Heme Proteins for Future Application, Catal. Surv. Asia 2011, 15, 134-143. Nakajima, H., Shoji, O., Watanabe, Y. 3. Rational engineering of Thermus thermophilus Cytochrome c552 to thermally tolerant artificial peroxidase, J. Chem. Soc. Dalton Trans. 2010, 39, 3105-3114, Nakajima, H., Ramanathan, R., Kawaba, N., Watanabe, Y. 好熱菌由来のCyt c552は、高温でも機能するペルオキシダーゼに改変可能ですが、触媒反応の進行とともに急速に失活することが問題でした。この研究では、その失活の機構を明らかにすることで、高温下での反応おける触媒失活の抑制を可能にしました。 4. Engineering of Thermus thermophilus Cytochrome c552: Thermally Tolerant Artificial Peroxidase, ChemBioChem 2008, 9, 2954-2957, Nakajima H., Ichikawa Y., Satake Y., Takatani N., Manna SK., Rajbongshi J., Mazumdar S., Watanabe Y. 5. Reactivities of oxo and peroxo intermediates studied by hemoprotein mutants., Acc Chem Res 2007, 40, 554-562, Watanabe Y., Nakajima H. and Ueno T. 6. Characterization of peroxide bound heme species generated in reaction of thermally tolerant cytochrome c552 with hydrogen peroxide. ChemBioChem 2006, 7, 1582-1589, Ichikawa Y., Nakajima H., Watanabe Y. ペルオキシダーゼサイクルにおいて、Compound0と呼ばれる反応中間体は、寿命が短く、これまで極低温状態でのみ生成・観測が可能でした。我々は、好熱菌由来Cyt c552の極端に疎水的なヘム空間を利用することでCompound0を室温付近で生成させ、EPRによる観測と反応性の調査しました。

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窒素固定酵素の性質を遺伝子のレベルから理解する

詳細はこちら 人工的な窒素固定（空気中窒素のアンモニアへの還元反応）は、現在、全生態系における窒素固定量のおよそ10%に及び（文献1）、農業をはじめとする人類の生産活動にとって必要不可欠なものとなっています。そのほとんどは、ハーバー法によって賄われていますが、物質生産の省エネルギー化の観点から、高温･高圧を必要とする同法の代替プロセス開発はこれからますます重要な課題となってゆくでしょう。窒素固定酵素（ニトロゲナーゼ）を産生する細菌をバイオマスとして利用する方法は、代替プロセスの有力な候補の一つですが（文献1）、実現にはいくつかの課題があります。その一つに、「どのような生育環境下で、細菌の窒素固定化能は最大化するか」の理解が挙げられます。これまでなされてきた多くの研究結果から、ニトロゲナーゼの機能制御の第一段階は、ニトロゲナーゼ遺伝子の転写レベルで行われることが分かっていますので、機能制御機構を理解するには、何よりもまずニトロゲナーゼ遺伝子の転写調節機構を理解する必要があると言えます。我々の研究では、窒素固定酵素の一種である Azotobacter vinelandii（A. vinelandii）を対象に、制御機構の実体である転写制御タンパク質の作用機構を分子レベルで解明することを目指しています。 A. vinelandii とは、植物の根に寄生することなく窒素固定を行う細菌で水中や土中で生育します。古くよりゲノム解析が進んでおり、遺伝子操作が容易なことから、バイオマスへの利用が期待される窒素固定細菌の一つです（文献2）。この細菌では、3種類のニトロゲナーゼ（1、2、3）とその転写制御に関わる遺伝子の存在が特定され、図1の関係がずいぶん以前（1989年）に報告されています。以降、ニトロゲナーゼ-1の転写制御タンパク質であるNifALのペアについての研究は盛んに行われ、100報を上回る研究（2011年10月Web of Science調べ）の結果、NifALが何を環境因子として感知し、どのようなメカニズムでニトロゲナーゼ-1の転写制御を行うのか整理されつつあります。一方、ニトロゲナーゼ-2, 3 の転写制御タンパク質、VnfA、AnfAについては、同期間の研究報告数がともに10報程度と少なく、その制御機構については我々が研究を開始した時点でほとんど不明でした。その最大の理由は意外かもしれませんが、これらのタンパク質を組換え体として発現させた場合、不溶化してしまい、精製が極めて困難であるということでした。じつは、我々も当初同じ問題に直面しました。ただ、我々は以前より、金属含有転写制御タンパク質の精製と分光学的手法による機能解析研究に従事しており、その経験から、「VnfA、AnfA の不溶化は、大腸菌を使った組換え体発現系で補因子が発現したタンパク質にうまく組込まれないことに原因がある」との感触を初期の実験で得ました。そこで補因子として、VnfA, AnfAのN末端に位置するシステイン残基の集積配列（VnfA: -Cys8-X-Cys10-XXXX-Cys15-、AnfA: -Ser19-X-Cys21-XXXX-Cys26-）に着目し、この部位で、何らかの金属イオンまたは金属クラスタが配位すると予想し、VnfA、AnfAの可溶化と精製を再度試みました。その結果、鉄硫黄クラスタの生合成系を組換え体発現系へ新たに組み込むことで、VnfAを可溶性タンパク質として得ることに初めて成功し、さらに、VnfAが3Fe-4S型の鉄硫黄クラスタを有することを見出しました（図2）。3Fe-4Sクラスタを有する転写制御タンパク質は、ニトロゲナーゼ制御系のみならず、既知の転写制御系でも初めての例であり、その生理的意義は興味深いところです。タンパク質の生成・精製に成功した後も鉄イオウクラスターの定量とその役割の同定をはじめ、かなり困難な研究が続きましたが、最近では、VnfAの作用機構について、大まかなイメージが掴めるようになってきました（図3） A. vinelandiiのニトロゲナーゼ転写制御にかかわる遺伝子が報告されて以来、およそ20年間に研究の進展が著しいNifALとほとんど進展がみられなかったVnfA、AnfAの差は、精製したタンパク質が得られるか否かでした。タンパク質の精製に進展がみられない中、AnfAの全長を精製するのは難しいと判断し、一部分だけを発現・精製した例は過去にありましたが、結局、機能の本質を理解するには至りませんでした。我々の研究で、VnfAタンパク質の大量発現・精製の成功、および3Fe-4Sクラスタの発見に至ったことにより、この分野は再び活発化すると考えられます。今後、先行するNifA研究で得られた知見をも利用することによって、これまでのギャップを一気に解消し、ニトロゲナーゼ転写制御系全体の理解に拍車がかかることは間違いありません。我々の研究成果が契機となり、冒頭で述べた「ニトロゲナーゼが最大限に機能する細菌生育環境の理解」そして「バイオマスによる窒素固定」に大いなる進展が訪れるものと考えます。 　 引用文献) 1. “Nitrogen Fixation, 3rd Edition” John Postgate Ed., Cambridge University Press (1998). 2. “Genetics and Regulation of Nitrogen Fixation in Free-Living Bacteria” Werner Klipp and Bernd Masepohl Ed., Kluwer Academic Publisher (2004). 関連する我々の論文） 1. The role Fe-S cluster in the sensory domain of nitrogenase transcriptional activator VnfA Azotobacter vinelandii., FEBS J. 2010, 277, 817-832, Nakajima, H., Takatani, N., Yoshimitsu, K., Itoh, M., Aono, S., Takahashi, Y., Watanabe, Y. 1989年に遺伝子が同定されて以来、30年間に渡ってできなかったVnfAタンパク質の精製に成功しました。精製したタンパク質を解析することによって、これまで遺伝子レベルで予想されていた性状可否が数多く明らかとなりました。一つのハイライトは、このタンパク質が3Fe-4S型クラスターをセンサー部位として有することです。VnfA以前、センサーに利用される鉄イオウクラスターは、2Fe-2Sあるいは、4Fe-4S型のみでしたが、このタンパク質の同定で、ようやくすべてのタイプのクラスターがセンサーとして機能することが明らかとなりました。 2. The role of the GAF and central domains of the transcriptional activator VnfA in Azotobacter vinelandii, FEBS J. 2011, 278, 3287-3297, Yoshimitsu, K., Takatani, N., Kanematsu, Y., Miura, Y., Watanabe, Y., Nakajima, H. ニトロゲナーゼ転写調節因子 VnfAは３つのドメインから構成されており、各ドメインの機能については、既知タンパク質とのホモロジー解析から予想だけはされていました。我々は、精製したVnfAタンパク質をもとに、実験的にその機能を確認し、その定量化を進めました。それにより、VnfAの作用機構の全体像がみえるようになってきました。 3. Effect of nitric oxide on VnfA, a transcriptional activator of VFe-nitrogenase in Azotobacter vinelandii, J. Biochem 2015, 157, 365-375, Miura, Y., Yoshimitsu, K., Takatani, N., Watanabe, Y., Nakajima, H. 2010年の論文でVnfAがO2-を選択的に感知することを提案しましたが、その際問題となったのが、同じラジカル分子であるNOに対して、VnfAがどのような応答示すかでした。この論文は、その問いに対する答えです。VnfAの3Fe-4S型クラスターは、O2-の場合完全に分解されますが、NOとの反応では、2種類の鉄にニトロシル錯体を生成し、量論比に応じて生成し、VnfAの転写活性化能を50%程度に抑制することが分かりました。ただし、その生理的意義はまだ不明なままであり、今後の研究が必要です。

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